Tỷ lệ auxin : cytokinin trong nuôi cấy mô: mô sẹo, chồi, rễ

Trong nuôi cấy mô, cùng nền khoáng MS, chỉ cần đổi tỷ lệ auxin và cytokinin là mẫu cấy ra mô sẹo, chồi hay rễ. Nắm nguyên tắc này giúp chọn đúng chất cho từng giai đoạn và xử lý lỗi hay gặp: thủy tinh hóa, mô sẹo ngoài ý muốn, cây con khác giống mẹ.

Nguyên tắc Skoog–Miller

Năm 1957, Skoog và Miller (Đại học Wisconsin) nuôi đoạn thân và mô lõi thân thuốc lá với auxin IAA và cytokinin kinetin, và thấy:

• Phải có cả hai chất thì tế bào mới phân chia mạnh; thiếu một chất, mô mọc kém.

• Auxin cao, cytokinin thấp → ra rễ.

• Cytokinin cao, auxin thấp → ra chồi.

• Hai chất ở mức tương đương (hoặc cùng cao) → mô sẹo phát triển, không phân hóa rễ hay chồi.

• Cytokinin kìm ra rễ, auxin kìm ra chồi.

Từ đó có ba loại môi trường cơ bản: tạo mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ. Theo Melnyk (2023), để mẫu trên môi trường tạo mô sẹo vài ngày rồi mới chuyển sang môi trường tạo chồi cho tỷ lệ tái sinh cao và nhanh hơn tái sinh trực tiếp. Skoog–Miller là nguyên tắc định hướng; ngưỡng cụ thể thay đổi theo loài, mẫu cấy và hoóc-môn nội sinh.

Chọn auxin

• IAA: auxin tự nhiên; dạng muối kali như K-IAA tan trực tiếp trong nước.

• NAA: theo Pasternak và Steinmacher (2024), có chức năng gần IAA nhất nhưng bền hơn. Long và cộng sự (2022) ghi nhận IAA và NAA thúc đẩy phân hóa rễ bất định.

• IBA: nhiều quy trình tạo rễ dùng xử lý xung (pulse) IBA ở nồng độ tương đối cao kèm để tối.

• 2,4-D (cùng picloram, dicamba): "auxin dạng thuốc cỏ", gây stress và kích tế bào tự tổng hợp auxin, nên hay dùng để tạo mô sẹo phôi hóa và phôi vô tính. Long và cộng sự ghi: với đa số cây họ lúa, 2 mg/L 2,4-D là tối ưu để tạo mô sẹo phôi hóa; nhiều cây dược liệu dùng 5–10 µM (khoảng 1,1–2,2 mg/L). Nồng độ cao lại kìm; mô sẹo đã thành phôi thì bỏ 2,4-D.

Chọn cytokinin

• Zeatin: cytokinin tự nhiên.

• BA (6-BA, BAP): cytokinin nhân tạo dùng nhiều để nhân chồi. Polivanova và Bedarev (2022) ghi nhận BA ở mức tương đối thấp 4,4 µM (khoảng 1 mg/L) lẫn cao 8,9 µM (khoảng 2 mg/L) đều có thể gây thủy tinh hóa ở cẩm chướng, dưa lưới, hành, táo, thông.

• Kinetin: yếu hơn BA; thay BA bằng kinetin làm giảm thủy tinh hóa ở chồi táo và lê.

• TDZ (thidiazuron): hoạt tính kiểu cytokinin rất mạnh, đồng thời là một yếu tố gây stress. Ở cẩm chướng, TDZ chỉ 0,04–0,4 µM đã gây thủy tinh hóa; TDZ còn làm tăng sinh ethylene.

So sánh nhanh theo mục đích

• Tạo mô sẹo: auxin trội hoặc hai chất cân bằng; tạo mô sẹo phôi hóa thường dùng 2,4-D.

• Nhân chồi: cytokinin trội (6-BA, kinetin), auxin thấp.

• Ra rễ: auxin (IBA, NAA), không cytokinin. Pasternak và Steinmacher khuyên auxin ngoại sinh chỉ dùng ở giai đoạn cảm ứng vì dễ làm rối quá trình phát sinh cơ quan.

Lỗi hay gặp và cách xử lý

Thủy tinh hóa

Chồi thủy tinh hóa có thân mập, lóng ngắn, lá trong mờ, giòn, dài, xoắn, thiếu diệp lục, khó sống khi ra vườn ươm. Nguyên nhân: cytokinin cao, môi trường lỏng hoặc quá mềm, ẩm độ cao, ethylene và CO₂ tích trong bình kín, ammonium cao. Cách giảm:

• Hạ nồng độ cytokinin; thay BA bằng kinetin hoặc meta-topolin.

• Cấy luân phiên môi trường không hoóc-môn với môi trường có cytokinin (đổi lại hệ số nhân giảm).

• Tăng nồng độ agar, nhưng mẫu sẽ hấp thu cytokinin kém hơn.

• Thông khí bình nuôi để giảm ethylene, CO₂; giảm ammonium trong môi trường.

Mô sẹo mọc ngoài ý muốn

Khi cần cây đúng giống mẹ, mô sẹo ở gốc chồi thường liên quan đến auxin ngoại sinh dư hoặc dùng quá lâu. Trong nhiều trường hợp, mô sẹo bắt nguồn từ những tế bào có mức bội thể cao, khó tái sinh ra cây giống mẹ. Nên giảm hoặc bỏ auxin sau giai đoạn cảm ứng và ưu tiên nhân chồi nách.

Biến dị soma

Tổng quan của Krishna và cộng sự (2016) chỉ ra các yếu tố làm tăng biến dị:

• Qua giai đoạn mô sẹo: nhân chồi nách thường không tạo biến dị, nuôi qua mô sẹo thì tỷ lệ đột biến cao hơn.

• Chất điều hòa: nuôi lâu trên 2,4-D làm tăng mức bội thể tế bào mô sẹo; NAA, BAP, nhóm phenylurea cũng bị nghi gây biến dị. Ở violet châu Phi, thêm 0,5 ppm BA và 0,1 ppm NAA vào môi trường cấy mẫu lá làm tỷ lệ biến dị tăng mạnh.

• Tỷ lệ cytokinin/auxin cao làm tăng hoa dị dạng ("mantled") ở cọ dầu.

• Nuôi càng lâu, cấy chuyền càng nhiều thì biến dị càng tăng; nên giới hạn số lần cấy chuyền, kiểm tra độ đồng nhất di truyền bằng chỉ thị phân tử.

Lưu ý an toàn

• Đọc phiếu an toàn hóa chất (SDS) trước khi pha; 2,4-D là hoạt chất thuốc trừ cỏ.

• Đeo găng, kính, khẩu trang khi cân bột, pha dung dịch gốc; dán nhãn tên, nồng độ, ngày pha.

• Xử lý môi trường thải và bình nhiễm theo quy định phòng thí nghiệm.

Tóm lại

Skoog–Miller vẫn là kim chỉ nam: cytokinin trội cho chồi, auxin trội cho rễ, cân bằng cho mô sẹo. NAA, IBA cho ra rễ, 2,4-D cho mô sẹo phôi hóa; BA dễ gây thủy tinh hóa, kinetin dịu hơn, TDZ rất mạnh nên chỉ dùng liều thấp. Muốn cây con đúng giống, hạn chế mô sẹo, hạ hoóc-môn và số lần cấy chuyền.

Cần tư vấn chọn chất điều hòa sinh trưởng phù hợp, nhà vườn liên hệ CVGreen qua số tư vấn trên website.

Tài liệu tham khảo: Melnyk (Đại học Khoa học Nông nghiệp Thụy Điển) – Quantitative regeneration: Skoog and Miller revisited (Quantitative Plant Biology, 2023); Long và cộng sự – New insights into tissue culture plant-regeneration mechanisms (Frontiers in Plant Science, 2022); Pasternak, Steinmacher – Plant growth regulation in cell and tissue culture in vitro (Plants, 2024); Polivanova, Bedarev – Hyperhydricity in plant tissue culture (Plants, 2022); Krishna và cộng sự – Somaclonal variations and their applications in horticultural crops improvement (3 Biotech, 2016).

Ảnh minh họa: Syed Sajidul Islam, Wikimedia Commons (CC BY-SA 4.0).